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        脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的詳細操作步驟分享

        更新時間:2018-03-19  |  點擊率:3824
           脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染操作步驟

          1、操作步驟[方法一]:

          (1)脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染準備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

          (2)細胞培養(yǎng):取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿),向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液,37℃CO2培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。

          (3) 轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應酌情減量)。

          (4)轉(zhuǎn)染:把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

          (5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

          注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

          2、快速脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]:

          (1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時,使其達到50~60%板底面積。

          (2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體2000復合物方法如下:

          ①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

          ②旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入脂質(zhì)體2000懸液,旋轉(zhuǎn)。

          ③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結合在脂質(zhì)體2000上。

          (3)棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復合物,37℃培養(yǎng)3~5小時。

          (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時,

          (5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養(yǎng)24~48小時。

          (6)用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。

          3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下:

          (1)接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

          (2)DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前(2)、(3)步驟。

          (3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養(yǎng)48小時。

          (4)吸出DMEM,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞,使細胞生長一定時間,篩選轉(zhuǎn)染克隆,方法參照細胞克隆篩選法進行。